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192合成仪四个合成步骤说明

发布时间:2021-12-21      点击次数:296
  192合成仪的使用基本采用固相亚磷酰胺三酯法。亚磷酰胺三酯法合成DNA的片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的,相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

  192合成仪合成步骤如下:
  第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯*酸反应,脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基;
  第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3'端被活化,5'-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
  第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。
  第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
  经过以上步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯*酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

  192合成仪设备检测引物的纯度的方法是:
  实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的。如果条件许可,也可以用EB 染色或银染方式染色。


192合成仪

 

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