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引物是如何合成的?

发布时间:2022-07-19      点击次数:112
目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺y三酯法。该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成,由待合成引物的3'端向5'端合成延伸,相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
 
固相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下:
 
1) 用三氯-乙酸去除固相载体5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基;
 
2) 将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,与游离的5'-羟基发生缩合反应;
 
3) 由于无法保证完全的5'-羟基都参与缩合,可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%),可用乙酸酐和1-甲基咪唑试剂将其终止合成,这种短片段可以在纯化时分离掉;
 
4) 在氧化剂的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯,使DNA磷酸骨架更稳定。
 
经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸就被连接到固相载体上。重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基连接完成。合成过程中可以监控脱下的保护基团DMT的颜色可以初步判定合成效率。
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